肉毒桿菌及肉毒素

肉毒素簡介

肉毒毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由厭氧的肉毒桿菌在生長繁殖過程中產生的一種細菌外毒素，它能引起死亡率極高的中毒。自古以來，倒在這種毒素下的人類生命不計其數，而且在西方尤其多見。西方人很早就發現，吃肉制品容易發生肉毒素中毒癥。Botulinum這個詞匯，就源自于“肉腸”的拉丁文botulus；而中文譯為“肉毒素”也是這個緣故。在分子數相同的條件下，其致死力是白喉毒素的300倍，蓖麻毒素的3萬倍，銀環蛇毒素的300萬倍，箭毒的10億倍，是目前已知的毒力最強的分子，被美國疾病控制預防中心(CDC)列為A級生物恐怖劑。

肉毒梭菌及其毒素根據毒素抗原性的不同，將其分為A、B、C、D、E、F和G七個亞型。其中A、B、E、F為人中毒型別，C、D型為動物和家禽的中毒型別。C型肉毒梭菌在自然界廣泛分布。飲食污染有C型肉毒梭菌特別是C型肉毒毒素的水源或草料的動物有可能發生C型肉毒中毒。動物中毒后，20小時左右甚至幾小時內即可致死，死亡率極高，常常來不及用抗毒素進行特異性治療。肉毒中毒發生后，若不及時采取措施，則會引起其它食肉動物因食用中毒動物尸體而死亡或攜帶肉毒梭菌，造成肉毒梭菌在自然界中的傳播與潛伏，有可能引起范圍更廣、更嚴重的肉毒中毒，并危害人類健康。

肉毒毒素不耐熱，90℃情況下2分鐘可完全破壞；不耐堿，溶解在pH11的堿性溶液中3分鐘就可滅活。肉毒毒素溶液加0.6%的福爾馬林37℃下作用一個月以上可失去毒性，但仍保持抗原性和免疫原性，成為類毒素。肉毒素對乙醇穩定；但可被鹵素滅活。粗制毒素較精制毒素穩定。毒素溶液在pH6.0，4℃下保存，效價可保持半年不變。凍干毒素在低溫條件下可長期保存，毒性下降緩慢。

肉毒素發現及應用史

19世紀20年代：德國醫生Justinus Kerner從變質的香腸中發現了一種引起食物中毒的毒素。由于Kerner的“香腸之毒”導致麻痹癱瘓性疾病，因而獲得了“肉毒之毒”(來源于拉丁文“botulus”)的稱號。Kerner推測，小劑量的肉毒素也許可以用于治療神經紊亂性疾病以及多汗癥。1895年，比利時細菌學家Emile Pierre van Ermengem發現，肉毒桿菌可以產生肉毒素。20世紀20年代，美國舊金山加利福尼亞大學的Herman Sommer博士以穩定的酸沉淀形式最先從肉毒桿菌中提煉出A型肉毒素。

20世紀40年代，第二次世界大戰期間，美國科學家開始探索肉毒素的潛在用途，試圖將它變成戰爭的武器。1949年，在英國倫敦，研究人員Arnold Burgen博士和他的同事們發現，肉毒素可以阻斷神經和肌肉的聯系。20世紀60年代，舊金山眼科醫生Alan Scott將肉毒素注射入猴子體內，觀察它們是否可以令導致斜視的肌肉放松下來。1978年，Scott醫生獲得了美國食品和藥物管理局(FDA)的批準，進行關于肉毒素用于治療人類斜視問題的廣泛動態測試。他將這種藥物命名為Oculinum，并且創建了Oculinum公司來生產及出售這種藥物。1989年，Oculinum獲美國FDA批準用于治療斜視及眼瞼顫動。

1986年，加拿大Carruther夫婦在用肉毒桿菌毒素治療眼瞼痙攣時，意外的發現了其良好的除皺效果。隨后，他們相繼用肉毒素對額紋、眉間紋、魚尾紋進行了治療，經過了一系列嘗試，于1992年首先報道，Carruther夫婦就成了此項技術的發明者和先驅。2002年4月15日，肉毒素獲美國FDA批準用作醫學美容材料，主要用于注射除皺，暫時性地改善中度至重度的眉間皺紋，這一重大事件無疑使肉毒素成為愛美人士的“面部救星”。時至今日，肉毒素仍然是很多愛美之人瘦臉、除皺的理想選擇。1993年，中國蘭州生物制品研究所自主研發的A型肉毒素制品——衡力問世。2006年，GSK在中國上市保妥適(BOTOX)。

肉毒素的作用機制

Crystal structure of botulinum neurotoxin A1 (BoNT/A1)

肉毒素是一種蛋白類毒素。菌株細胞內所翻譯的原初蛋白為150kDa的一條多肽鏈；隨后通過蛋白酶的作用，在跨越二硫鍵的環狀區域進行切割，形成成熟的肉毒毒素，由50kDa的輕鏈(L鏈)及100kDa重鏈(H鏈)構成，如上圖所示。重鏈和輕鏈之間通過一個分子內二硫鍵及不同結構域間的非共價相互作用而構成三維結構。目前科學人員已經解析了BoNT/A1，BoNT/B1及BoNT/E1的晶體結構。同其他作用于細胞內靶點的細菌毒素類似，BoNT也由功能不同的結構域所組成：輕鏈編碼毒性功能區，為一金屬蛋白酶活性區域，能夠特異性切割SNARE家族蛋白，后者對于神經遞質的分泌是必須的；HN結構域對于輕鏈穿越內吞小體轉位至神經元細胞質至關重要；而HC結構域負責突觸前結合和內吞，其自身由兩個不同結構的亞結構域所構成。氨基酸序列的保守性及結構分析表明：BoNT/C， BoNT/D和BoNT/G同BoNT/A及BoNT/B較為相似；而BoNT/E同BoNT/F之間相似度更高。肉毒毒素通常是由神經毒素和血凝素組成的復合形式存在。

Neurotransmission at synapses

肉毒素的毒性機理主要為抑制神經遞質對細胞信號的傳遞過程。化學突觸中的信號是由神經遞質介導的，這些神經遞質從突觸前神經末梢釋放出來，并與位于突觸后細胞(如肌肉或外分泌細胞)的受體結合。神經遞質在神經元胞漿中合成，并儲存在突觸前神經末梢內的小突觸小泡中。在突觸囊泡腔中神經遞質的積累主要是由質子電化學梯度所驅動，后者由ATPase質子泵產生的，它位于突觸囊泡膜上并利用ATP水解釋放的能量將ATP泵入突觸小泡。突觸小泡在神經末梢形成一個神經遞質的儲備池，并與突觸前膜成為活性區域的特定部位結合，稱為“docking”。多種蛋白分子逐步形成一個較大的復合體，來完成突觸小泡的docking過程。該復合體包括兩個突觸囊泡上的膜蛋白，VAMP (synaptobrevin)及Syt (synaptotagmin)；兩種位于突觸前膜的蛋白，SNAP25及syntaxin；以及胞漿蛋白complexin和Munc18，來參與后續步驟，即使得突觸囊泡能夠響應鈣離子內流的信號而快速同突觸前膜區域相融合。Syt分子同突觸前膜上的肌醇磷脂分子相互作用，而VAMP則同SNAP25及syntaxin形成coiled-coil結構，也被稱之為SNARE復合體。Docking過程完成后，complexin同Munc18一起發揮剎車的作用而阻止融合過程的即刻發生，并促進其他蛋白形成一個更大的超級SNARE復合體，這也是介導神經遞質釋放的最核心結構。神經末梢的去極化會導致膜上鈣離子通道的打開以及大量鈣離子的進入，從而引發復合體的快速構象變化，使得突觸囊泡與突觸前膜融合而將神經遞質釋放至突觸間隙。神經遞質擴散到神經末梢，并與突觸后受體結合，從而觸發突觸后細胞的信號傳導。在神經遞質釋放過程中，突觸囊腔瞬時對外開放，但隨后通過內吞作用內化入神經末梢。神經遞質的胞吐和內吞是嚴格耦合的：一個過程的抑制導致另一個過程的抑制。內化和脫殼后，突觸小泡再次填充入神經遞質，神經傳遞的下一個周期重新開始。

Binding and trafficking of botulinum neurotoxins inside nerve terminals

在體內，肉毒毒素特異性的與膽堿能神經末梢突觸前膜的表面受體相結合，然后由于吸附性胞飲而內轉進入細胞內稱為毒素的內轉(internalization)，使囊泡不能再與突觸前膜融合，從而有效地阻抑了膽堿能神經介質——乙酰膽堿的釋放。與此同時，毒素與突觸前膜結合，還阻塞了神經細胞膜的鈣離子通道，從而干擾了細胞外鈣離子進入神經細胞內以觸發胞吐和釋放乙酰膽堿的能力。乙酰膽堿釋放的抑制，有效地阻斷了膽堿能神經傳導的生理功能，尤其是神經——肌肉接頭部位特別敏感，引起全身隨意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。

肉毒素的應用

20世紀70年代初美國舊金山眼科研究所的Scott醫師從肉毒中毒病人最先累及眼外肌，引起視力模糊、眼瞼下垂、瞳孔散大和復視等癥狀并緩慢恢復的過程中得到啟示，與世界著名肉毒毒素專家、美國威斯康星大學食品微生物及毒素學系Schantz教授合作，在猴實驗基礎上將肉毒毒素引入眼科疾病治療，并在1980年首次報告眼外肌注射A型肉毒毒素替代斜視手術治療的可能性。此后他和其他臨床專家對肉毒毒素的臨床效果、副作用及免疫學反應進行了大量的實驗研究，并在斜視、眼瞼痙攣、面肌痙攣等疾病的治療中取得了令人鼓舞的結果。迄今，國外報道肉毒毒素已可用于眼科、神經科、康復科、消化科、泌尿科、皮膚科及美容科等50余種病癥(很多是疑難雜癥、難治之癥)的治療。

肉毒素類藥物中的明星BOTOX(保妥適)

市售的A型肉毒毒素產品至少有6種：OnabotulinumtoxinA (美國BOTOX，Allergan)，BTXA (中國衡力，蘭州生物制品研究所)，Abobotulinumtoxin A (英國Dysport，Ipsen Ltd)，Rimabotulinumtoxin B (美國Neurobloc，Solstice Neurosciences)，neu-BoNT/A (韓國Neuronox，Medytox)，Incobotulinumtoxin A (德國Xeomin，Merz Pharmaceuticals)。這些產品根據分子特性和血清類型分為3類：A型復合肉毒毒素(onabotulinumtoxin A，bobotulinumtoxin A，BTXA和neu-Bo NT/A)、A型復合游離肉毒毒素(incobotulinumtoxin A)和B型肉毒毒素(rimabotulinumtoxin B)。這其中，onabotulinumtoxin A自1989年在美國獲批后一直占據市場，Abobotulinumtoxin A緊隨其后，自2009年FDA批準其用于治療頸部肌張力障礙和重度眉間紋后，就一直在歐洲、亞洲、拉丁美洲和美國應用。Incobotulinumtoxin A于2005年在德國問世，在美國應用。neu-BoNT/A于2006年在韓國獲批用于治療眼瞼痙攣，已在亞洲和拉丁美洲國家成為最為接受的肉毒毒素產品之一，在日本、韓國、泰國等用于治療和美容適應癥。對于肉毒素類產品適應癥多樣性的研究正如火如荼的展開，其中BOTOX還登上了2017年1月16日時代雜志的封面。

BOTOX實際是A型肉毒桿菌毒素，其活性成分為BoNT/A復合物，分子量約為900kDa，由一個神經毒素分子、一個非毒素非凝集素蛋白和血紅蛋白凝集素(HA)蛋白構成。這是一種神經毒劑，可以抑制運動神保妥適經沖動的傳遞，而使局部肌肉不能收縮或是肌肉張力下降。1989年，A型肉毒桿菌毒素正式注冊為商品，商標為“BOTOX”，并被美國食品藥品管理局(FDA)核準用于12歲以上的肌肉張力性疾病，如斜視，眼肌痙攣等的治療，近幾年才被用于美容整形，主要是治療面部皺紋。BOTOX注入產生皺紋的肌肉內，會阻斷神經遞質乙酰膽堿的釋放，從而使肌肉張力下降或是肌肉癱瘓麻痹，皺紋也隨之而逐漸消失，皺紋去除效果頗佳，特別是對額紋(抬頭紋)、眉間紋、魚尾紋，且操作簡單，幾乎無痛苦，無腫脹瘀血，見效快，不發生過敏反應等，故這種除皺方法推出后，被許多求美者所接受。

BOTOX發現及FDA批準歷程

在Alan Scott(艾倫.斯考特)教授先驅性地將A型肉毒毒素應用于治療斜視和眼瞼痙攣的實驗后，艾爾建公司獲得了他的授權技術并使該產品通過了FDA批準，用于一系列治療及美容適應癥：1989年獲批用于治療眼瞼痙攣和斜視；2002年獲批用于治療中度至重度眉間紋；2013年獲批用于治療眼外眥皺紋(魚尾紋)。2016年，FDA批準了BOTOX用于治療成人患者的下肢痙攣。這是FDA批準的第一種也是唯一一種肉毒桿菌毒素產品，用于治療上肢(肘部、腕部、手指和拇指)和下肢可能受到痙攣影響的多個肌肉群。另外，近些年BOTOX還獲批用于上肢痙攣、慢性偏頭疼、神經性尿失禁、膀胱過度活動綜合征等多種適應癥。全球范圍內，保妥適在過去的20年中已獲83個國家的批準，被用于27種不同的適應癥。BOTOX是一座名副其實的超級“金礦”，而且從目前看來，這座金礦似乎絲毫未現枯竭之態。

原標題：肉毒素的故事——不只用于美容

縮略詞：

BoNT：botulinum neurotoxins

CNS：central nervous system

HSA：human serum albumin

HC：carboxy-terminal partof heavy chain

HC-C：C-terminal part ofthe HC domain

HC-N：N-terminal part of HC

HN：amino-terminal partof heavy chain

L：light chain

PSG：polysialoganglioside

PTC：progenitor toxin complexes

SV：synaptic vesicle

VAMP：vesicle-associated membrane protein

SNARE：soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor

參考文獻：

1.AbobotulinumtoxinA:A 25-Year History. Aesthet Surg J. 2017 May 1；37(suppl_1):S4-S11. doi: 10.1093/asj/sjw284.

2.https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin

3.Botulinum Neurotoxins: Biology，Pharmacology，and Toxicology. Pharmacol Rev. 2017 Apr；69(2): 200–235.

4.Currentand potential urological applications of botulinum toxin A. Nat Rev Urol. 2015Sep；12(9):519-33. doi:10.1038/nrurol.2015.193.

5. http://www.botox.com/