有史以來第一次，科學家們終于找到了一種可以有效、精確地從免疫系統的T細胞中去除基因并插入外源正常基因的方法，而且更重要的是，這種操作所需的時間比通過病毒載體進行基因遞送的時間短得多。

專家表示，如果該技術可以在其他實驗室中復制，那么它可能為治療一系列疾病開辟了新的可能性，包括癌癥，HIV感染，狼瘡和類風濕性關節炎等自身免疫疾病。相關的研究結果于2018年7月11日發表在《Nature》雜志上，賓夕法尼亞大學免疫學研究所主任John Wherry博士對此評價到：“這是一項重大進展”。

病毒載體制造瓶頸

眾所周知，病毒在感染時可以有效地將其遺傳物質引入靶細胞，并依賴宿主細胞進行復制。自20世紀70年代以來，科學家們便利用這種能力，剝離病毒傳染特性，使用其產生的“病毒載體”將DNA遞送到細胞中去以達到基因治療的目的，而且近年來發展迅猛的CAR-T細胞療法也是基于病毒載體對T細胞進行工程化設計的，這種遞送系統是包括CAR-T在內的許多形式的基因治療的核心。

現如今，這種CAR-T細胞產品已經被FDA批準上市。毫不夸張的說，沒有病毒載體，就沒有這種突破性療法，但制造這種病毒是一項艱苦而昂貴的過程，臨床級病毒載體的短缺導致了基因療法和基于細胞的療法的制造瓶頸。賓夕法尼亞大學佩雷爾曼醫學院的基因治療項目負責人James M. Wilson在接受紐約時報采訪時，曾表示新病毒的等待時間可能長達數年。

而且即使可用，病毒載體也遠非理想的方式，因為它們將基因隨意插入細胞基因組中，可能會損害現有的健康基因，或者保留新引入的基因，這些基因不受確保細胞正常運作的調節機制的影響，可能會導致嚴重的副作用。

因此，目前美國FDA要求對接受過病毒式轉導T細胞的患者進行15年的隨訪。

如果不用病毒載體遞送基因呢？事實上，在不使用病毒的情況下設計T細胞的想法并不新鮮，但免疫細胞很脆弱，很難在實驗室中保持活力，而將所需基因導入細胞中更是難上加難。

新技術到底有何過人之處呢？

Nature中描述的新方法提供了一種強大的分子“切割和粘貼”系統，用于重寫人類T細胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，是一種將電場施加到細胞上使其膜暫時更具滲透性的過程。在一年內試驗了數千個變量之后，加州大學舊金山分校(UCSF)的研究人員發現：

當一定數量的T細胞，DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在適當的電場中時，T細胞將會在吸收這些元素，精確地將特定的基因序列整合到基因組中的CRISPR編程位點。

作為論文通訊作者，UCSF的 Alex Marson博士表示：這是一種快速，靈活的方法，可用于改變、增強和重新編程T細胞，因此我們可以用這種方法實現我們想要的特異性，以消除癌癥，識別感染，或者遏制自身免疫性疾病中出現的過度免疫反應。換句話說，現在我們已經贏在了這條戰線的起點上。

但同樣重要的是新技術的速度和易用性，Marson表示：“這種方法可以將大量的DNA插入到T細胞中，賦予了細胞強大的新屬性。而在此之前，Marson實驗室的成員使用電穿孔和CRISPR將一些遺傳物質插入到T細胞中已經取得了一些成功，但直到現在，許多研究人員多次嘗試將長序列的DNA置于T細胞中，通常都會導致大多數細胞死亡，因此大多數人認為大型DNA序列對T細胞的毒性太大。

Theo Roth博士是論文的第一作者，他設計并領導了這項研究。他表示，嘗試將新基因導入T細胞已經有三十年的研究歷史了，現在，我們不在需要六七個人在實驗室里使用病毒來設計T細胞了。在這種需求越來越大，所需要導入的DNA序列越來越復雜的環境中，我們需要的是嘗試更多的可能性，推動下一代細胞療法的快速發展。

經過近一年的反復試驗，Roth確定了T細胞群，DNA量和CRISPR豐度的比例，結合使用適當參數傳遞的電場，可以有效且準確地對T細胞基因組進行編輯。為了驗證這些發現，Roth指示CRISPR用綠色熒光蛋白(GFP)標記一系列不同的T細胞蛋白，結果表明：這種操作是高度特異性的，脫靶的幾率非常低。

然后，在補充實驗中，Roth，Marson及其同事展示了這項新技術用于整合T細胞對抗自身免疫性疾病或癌癥的潛力。

自身免疫性疾病

在第一個例子中，Roth及其同事使用耶魯大學醫學院Kevan Herold博士提供給Marson實驗室的T細胞。這些細胞來自三個患有罕見、嚴重的自身免疫性疾病的兄弟姐妹，迄今為止一直對治療抵抗力。基因組測序顯示這些兒童的T細胞攜帶一種名為IL2RA的基因突變。該基因帶有細胞表面受體的指令，這些細胞表面受體對于調節T細胞或Tregs的發育是必需的，其可以控制其他免疫細胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技術修復IL2RA缺陷(圖片來源 nature)

實驗結果表明：利用非病毒CRISPR技術，UCSF團隊能夠快速修復兒童T細胞中的IL2RA缺陷，并恢復受突變影響的細胞信號。在CAR-T治療中，患者自身的T細胞被設計為具有強抗癌能力的CAR-T，然后回輸到體內以靶向腫瘤，研究人員希望類似的方法也可以有效治療Tregs出現故障的自身免疫性疾病。

抗癌潛力

在與加州大學洛杉磯分校Parker癌癥免疫療法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作進行的第二組實驗中，科學家們完全取代了正常人類T細胞群中的天然T細胞受體，專門設計了用于尋找人類黑色素瘤細胞的特定亞型的新受體。其中T細胞受體是細胞用于檢測疾病或感染的傳感器，在實驗室培養中，工程化細胞有效地歸巢于靶向黑素瘤細胞而忽略其他細胞，表現出了高度的特異性。

非病毒工程化的人T細胞進入腫瘤部位并顯示出抗癌活性(圖片來源 nature)

實驗結果表明：在不使用病毒的情況下，研究人員能夠生成大量經過重新編程的CRISPR工程化細胞，表達出新的T細胞受體。當轉移到植入人黑素瘤腫瘤的小鼠中時，工程化的人T細胞進入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。

Marson說“這種替代T細胞受體的策略可以推廣到任何T細胞受體，通過這種新技術，我們可以剪切并粘貼到指定的位置，重寫基因組序列中的特定頁面。”

HIV感染

另外，Wherry博士還表示，這項技術對治療HIV也很有希望。HIV病毒感染T細胞，如果它們可以經過工程化設計，使得病毒不能進入T細胞，那么感染HIV的人，就不會進展到艾滋病。那些已被感染的T細胞會死亡，而工程化細胞會取而代之。雖然先前已有研究表明，通過這種方式有可能治療HIV。但現在有了一個非常有效的新方法來做到這一點。

由于新技術可以在差不多一周的時間內創建可行的定制T細胞系，因此它已經改變了Marson實驗室的研究環境。由于病毒載體帶來的障礙，之前認為過于困難或昂貴的實驗的想法現在已經可以進行了。Roth表示，他們將研究20個'瘋狂'的想法，因為可以非常快速地創建CRISPR模板，而一旦有了模板，他們就可以將它放入T細胞并快速生長。”

功夫不負有心人：Marson博士將新方法的成功歸功于Roth的“絕對堅持”，面對人們普遍認為病毒載體是必需的，并且T細胞只能容忍小片段DNA。 Roth確信能夠找到合適的條件來克服這些明顯的局限性，并且他付出了巨大努力來測試數千種不同的條件：CRISPR與DNA的比例；細胞培養的不同方式；不同的電流。通過優化每個參數并將最佳條件放在一起，最終他得到了這個驚人的結果。

目前，科學家們正在與美國FDA討論如何使用新方法精確攻擊實體腫瘤以及血血液腫瘤，希望能夠盡快推動這一技術應用。

參考出處：

https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5

https://www.ucsf.edu/news/2018/07/411071/t-cell-engineering-breakthrough-sidesteps-need-viruses-gene-editing

https://www.washingtonpost.com/news/speaking-of-science/wp/2018/07/11/with-new-genes-and-an-electric-shock-scientists-turn-immune-cells-against-cancer/?noredirect=on&utm_term=.8961e28cf9ff

https://www.nytimes.com/2018/07/11/health/gene-editing-cancer.html